Hey guys，今天我们分享中国医生最新的研究，很多人都在说，III型胶原蛋白真的是打的剂量越大越好吗？相信看完这个研究，大家心里都会有答案。老规矩我们先致敬原作者：

胶原蛋白是人体结缔组织中含量最丰富的结构蛋白，约占体内总蛋白质含量的30%。它是皮肤、骨骼、肌腱和韧带等结缔组织的关键成分，提供力量和弹性。胶原蛋白有多种类型，其中I型和III型在皮肤中占主导地位，分别占皮肤总胶原蛋白的70%和15%左右。人们普遍认为，在衰老过程中，细胞外基质中胶原蛋白的降解增加和合成减少会导致皱纹的形成和皮肤弹性的下降。2到目前为止，已经开发了几种皮肤填充剂，如胶原蛋白、透明质酸和羟基磷灰石钙，来弥补细胞外基质容量的流失。在这些填料中，胶原蛋白因其低不良反应率、高生物相容性和天然填充效果而具有广阔的潜力。

得益于基因工程的进步，编码胶原蛋白生产的人类特定基因片段可以整合到酵母和细菌等新的生产系统中。这使得胶原蛋白的合成稳定高效，与人体具有高度的生物相容性。这种类型的胶原蛋白被称为重组胶原蛋白。中国国家药品监督管理局发布了重组胶原蛋白定义标准指南，将重组胶原蛋白产品分为3类：（1）重组人胶原蛋白：由特定的人胶原蛋白基因编码，具有三螺旋结构的全长氨基酸序列；（2）重组人源化胶原（rhCol III）：定义为由特定人胶原基因编码的全长或片段功能氨基酸序列，或此类功能片段的组合；（3）重组胶原样蛋白：由设计和修饰的特定胶原基因编码的氨基酸序列或片段，或这些片段的组合组成。事实上，到目前为止，重组人胶原蛋白的生产仍然极具挑战性。大多数参与胶原蛋白生产的公司或机构只能生产rhCol III。由于rhCol III具有更先进的大规模生产技术和与重组人胶原蛋白高度相似的结构，作者认为rhCol III最有希望尽早实现临床转化。III型胶原蛋白（COL III）是一种微小的纤维，通常与I型胶原蛋白（COL I）共存，为皮肤提供弹性。研究表明，COL III在皮肤衰老过程中降解最快，COL III/COL I比值越高，皮肤越年轻，术后疤痕越不明显，质量越高。此外，COL III已被证实具有促进皮肤修复和再生的能力。鉴于COL III的这些特性，可注射的重组人源化III型胶原蛋白在临床美容应用和转化机会方面具有相当大的潜力。

迄今为止，只有少数体内研究表明重组胶原蛋白与伤口愈合和缓解光老化有关，而缺乏对皮内注射不同浓度的重组III型胶原蛋白对皮肤整体影响的连续观察研究。本研究旨在使用微针注射递送将不同浓度的重组人源化III型胶原有效地注射到小鼠真皮中，并在不同时间点连续观察其对皮肤胶原沉积、细胞增殖和血管生成的影响。

材料和方法

动物实验

从北京大学第三医院实验动物中心购买了20只8周龄的BALB/c小鼠（25±2g）。该动物实验已获得北京大学第三医院伦理委员会的批准。

注射前一天，将小鼠背部剃毛，每个剃毛区域分为4个象限。从左上象限到右下象限，作者使用微针注射递送依次注射了100μL生理盐水、低浓度（6mg/mL）rhCol III（YF20231118，Jland Biotech，中国）、高浓度（30mg/mL）rhColon III（YF20220905，Jland生物技术，中国）和生理盐水（图1）。2种rhCol III产品仍在研究中。作者分别将低浓度和高浓度rhCol III注入2个对角象限，以防止扩散相互作用。实验分为3组：对照组（生理盐水注射）、低剂量（LD）组（低浓度rhCol III）和高剂量（HD）组（高浓度rhColIII）。在注射后第1、2、3和4周，随机杀死相同数量的小鼠。采集全层皮肤样本进行后续组织学评估。为了便于描述，作者将在以下文本中分别将注射后第一、第二、第三和第四周称为第一、第三、第四观察点。

图1：（A）微针注射输送。它主要由3个部分组成，包括微针头、5-mL注射器和机身。（B） 注射器和微针头的放大图像。（C） 微针头的放大图像。

苏木精、曙红和Masson三色染色

将收获的全层皮肤在4%多聚甲醛中固定24小时，然后将其包埋在石蜡中并切成5μm的切片。苏木精和伊红（H&E）用于检查皮内注射对皮肤整体状况的影响，如表皮和真皮的厚度以及成纤维细胞的浸润。Masson三色染色用于观察注射部位整体胶原沉积的变化。

免疫组化

为了进一步研究不同浓度rhCol III皮内注射之间的差异，作者对收集的皮肤组织进行了I型胶原、III型胶原、PCNA和CD31的免疫组织化学染色。简而言之，首先对切片进行脱蜡和再水化，然后进行两轮微波加热以回收抗原。然后用3%过氧化氢处理切片，并用5%山羊血清白蛋白孵育。随后，它们分别与以下抗体在4°C下孵育过夜：I型胶原（1:500，ab138492；Abcam，美国）、III型胶原（1:100，ab6310；Abcam）、PCNA（1:1000，ab29；Abcam；）和CD31（1:200，GB113151；Servicebio，中国）。然后，在室温下用HRP二抗（1:200；Abcam）孵育1小时，然后用二氨基联苯胺显像。用苏木精复染后，将切片脱水并固定。

双光子激光扫描图像采集

使用双光子激光扫描显微镜（TCS-SP8 DIVE；Leica，德国）评估胶原蛋白的质量。简而言之，使用×20物镜（NA=1）将激发光束聚焦到采集的皮肤上。使用850nm的激光脉冲来获取胶原蛋白的二次谐波产生信号，使用400至450nm的带通滤波器进行检测。所有图像均在LAS X软件（Leica，德国）中采集和处理。

定量统计分析

为了定量分析总胶原沉积、I型胶原、III型胶原、PCNA和CD31的变化，作者在每组切片中以相同的放大倍数随机选择5个区域，并使用ImageJ软件进行定量。在GraphPad Prism 8.0.2（加利福尼亚州拉霍亚）中，使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析确定不同组之间的统计显著性。p<0.05的差异被认为具有统计学意义。为了更明显地说明HD组、LD组和对照组之间的差异，所有数据都以相对于对照组的倍数表示。

结果

苏木精和曙红染色

代表性的H&E染色图像如图S1A所示。作者首先研究了注射rhCol III是否会引起真皮的炎症反应。在4周内，没有观察到明显的炎症浸润或肉芽肿形成，表明具有良好的生物相容性。此外，实验组和对照组的皮肤厚度没有显著差异。在第一个观察点，HD组和LD组均表现出轻度表皮增厚。然而，与对照组相比，只有HD组在表皮增厚方面显示出统计学上的显著差异（p<0.05），并且这种增厚仅在第一个观察点出现（见图S1B）。与对照组相比，LD组在第二个（p<0.05）和第四个（p<0.01）观察点的毛囊数量显著增加。相比之下，HD组的毛囊数量没有显著增加。与对照组相比，HD组在所有4个观察点的成纤维细胞数量均显著增加（p<0.0001）。在第一点（p<0.0001）、第三点和第四点（p<.05），HD组的成纤维细胞也比LD组多。尽管LD组也表现出成纤维细胞数量的增加，但这种增加通常不如HD组明显。与对照组相比，LD组的成纤维细胞数量最多增加了1.98倍，而HD组最多增加了2.5倍。

图S1

胶原沉积

在这项胶原蛋白沉积变化的研究中，作者最初使用Masson三色染色评估了整体胶原蛋白的变化，并使用双光子显微镜检查了胶原蛋白的质量。最后，通过Col III和Col I的免疫组织化学染色评估III型和I型胶原的差异。

在注射后的初始观察中，LD组和HD组均表现出胶原沉积增强（p<0.001），在这一点上没有观察到显著差异（见图S2A、B）。 然而，从第二个观察点开始，HD组比LD组表现出更明显的胶原沉积（p<.0001）；尽管在随后的2个观察点，这种显著差异有所减小，但一直持续到第四次观察。此外，LD组显示胶原蛋白最大增加1.87倍，而HD组显示峰值增加2.97倍。在所有4个观察点，与对照组相比，LD和HD组的胶原蛋白水平均有不同程度的增加。胶原沉积的初步观察支持，无论浓度如何，皮内注射rhCol III都会导致更明显的胶原沉积，这种效果持续了4周以上，高浓度的rhCol III皮内注射在初始阶段后显示出更多的胶原沉积。图2显示了双光子显微镜结果的代表性图像。在图像中，白色信号代表胶原纤维。更亮的白色信号和更清晰的纹理排列表明胶原蛋白沉积更多，胶原蛋白排列更有序。这些结果还表明，注射rhCol III以浓度依赖的方式促进了总胶原沉积。此外，胶原纤维排列得更加有序（红色箭头），这意味着注射部位胶原的整体质量得到了改善。

图2：注射后1至4周，对照组、LD组和HD组的双光子激光扫描图像的代表性图像。红色箭头指向胶原蛋白沉积增加和胶原纤维排列更有序的区域。HD，高剂量；LD，低剂量。

图S2

然后，作者评估了III型胶原蛋白（Col III）的变化。在HD组的所有观察点都观察到Col III的显著增加，是对照组的1.87倍（见图S3A、B）。 在LD组中，除第二点外，Col III在所有点都显著增加，最多是对照组的1.59倍。在第二和第四个观察点，HD组Col III的沉积明显高于LD组（p<0.01）。这表明，不同浓度的rhCol III在开始时可能不会表现出明显的差异，类似于总胶原蛋白的分析。

图S3

除Col III外，Col I在两组中也显示出不同程度的上调（见图S4A和B）。 在HD组中，4个观察点中有3个观察点的上调具有统计学意义，与对照组相比，上调倍数最高为1.79倍。在LD组中，与对照组相比，只有第二个观察点的增加具有统计学意义（p<0.05）。尽管与LD组相比，HD组Col I的上调仅在第四个观察点具有统计学意义（p<0.05），但在所有观察点，HD组的Col I沉积量均高于LD组。将HD组和LD组与对照组的比较相结合。这一结果可以证明HD组具有更强的诱导Col I产生的能力。

图S4

细胞增殖与血管生成

成纤维细胞是真皮中分泌Col I和Col III的原代细胞。先前的研究表明，体外用rhCol III构建的支架对促进成纤维细胞增殖有一定的作用，但缺乏直接皮内注射的研究。促进血管生成的能力也是评估皮肤填充剂的重要标准，因为皮肤中的血管密度随着年龄的增长而降低，表明血管生成在保持面部青春方面起着重要作用。因此，作者检测了皮肤组织中的PCNA和CD31染色，以评估成纤维细胞增殖和血管生成的变化。

PCNA染色显示，与对照组相比，HD和LD组在第二和第四观察点的细胞增殖明显更高（见图S5A、B）。 HD组在这些点上表现出更显著的成纤维细胞增殖增加（p<0.05）。然而，在第一和第三点没有观察到明显的变化，可能是因为对细胞外基质变化的反应延迟。15重要的是，PCNA染色中观察到的趋势与Col I染色中的趋势高度一致，这表明成纤维细胞增殖的上调与ColⅠ产量的增加之间存在很强的相关性。

图S5

在HD组中，第三和第四观察点观察到更多的血管生成，分别是对照组的1.61倍（p<0.01）和1.40倍（p<0.001）（见图S6A和B）。 与对照组相比，LD组在第一、第三和第四个观察点的血管生成也分别增加了1.56倍（p<0.01）、1.37倍（p<0.05）和1.27倍（p<0.001）。在所有观察点中，作者没有发现增加rhCol III的注射浓度会导致更多的血管生成。这表明注射rhCol III有助于血管生成，但这种作用不是浓度依赖性的。

图S6

讨论

III型重组人源化胶原蛋白因其优异的生物相容性和可制造性而受到广泛关注。在全球范围内，尽管一些临床研究已经证明了它在治疗网球肘和促进角膜再生方面的有效性，但大多数研究仍然局限于体外和动物研究。作者认为，rhCol III是一种非常有前景的皮肤填充剂，可广泛应用于整容手术领域。然而，目前缺乏不同浓度rhCol III皮内注射后皮肤变化的连续观察数据。因此，本研究使用微针注射装置将不同浓度的rhColIII注射到小鼠真皮中，并持续监测变化。

作者观察到，皮内注射rhCol III以浓度依赖的方式诱导胶原蛋白形成增加，这与他们的预期一致。然而，作者没有观察到皮肤厚度的显著变化，这与注射剂通常会增加皮肤厚度的临床经验相矛盾。这可能是由于更多的胶原蛋白沉积被重组为更致密的结构，而其他细胞外基质成分，如弹性蛋白和透明质酸，没有发生显著变化，导致皮肤容量没有显著变化。相关研究同样表明，胶原蛋白沉积的增加可能不会显著增加皮肤厚度。这项研究的一个重要发现是，尽管作者注射了rhCol III，但Col I在HD和LD组中都不同程度地上调，通常与Col III相似。作者将Col I的上调归因于成纤维细胞的增殖和迁移增强。据报道，成纤维细胞广泛表达整合素α1β1、α2β1和α11β1，它们可以与rhCol III中的GVOGEA、GASGER和GFOGER等识别位点相互作用，调节成纤维细胞的粘附、增殖和细胞外基质重塑。作者注意到，尽管成纤维细胞增殖没有明显变化，但在初始观察点成纤维细胞数量和胶原沉积增加。这表明rhCol III促进成纤维细胞迁移和粘附，这与Chen及其同事之前的研究一致。此外，他们的发现还表明，整合素配体相互作用抑制剂（RGD肽）可以阻断这种细胞粘附，进一步说明了整合素的关键作用。在PCNA染色的观察中，作者发现其趋势与Col I和Col III的趋势相关，在第二和第四个观察点有更显著的上调，表明在初始阶段之后，成纤维细胞增殖在ColⅠ和ColIII的沉积中起着主导作用。这项研究的结果还表明，增加皮内注射中rhCol III浓度对成纤维细胞增生水平的影响最大，因为HD组在第一个观察点的胶原蛋白水平没有明显超过LD组，这表明与LD组相比，HD组初始成纤维细胞粘附的增加并没有导致更高的胶原蛋白水平。在随后的观察点，HD组显示出更强的促进成纤维细胞增殖的能力，导致HD组的胶原蛋白水平明显高于LD组。

血管密度是保持面部年轻的关键因素，也是皮肤填充剂的重要评价标准。研究表明，血管密度随着年龄的增长而降低，注射VEGF-A可以促进皮肤再生。之前的研究评估了某些非生物相容性皮肤填充剂，如羟基磷灰石钙和聚双旋乳酸对皮内血管生成的影响，显示了它们在增强血管生成方面的有益作用，但他们没有评估填充剂是否具有浓度依赖性作用。这项研究的结果表明，皮内注射rhCol III会在后期增强局部血管生成，而不管浓度依赖性如何。

这项研究有一些局限性。首先，结果主要基于组织学评估，这是一种相对有限的评估方法。其次，在观察期（4周）内，胶原蛋白沉积仍处于显著上调阶段，未来的研究可能需要延长观察期，以评估rhCol III皮内注射的长期效果。第三，作者没有对未经治疗的皮肤进行组织学检查。先前的研究表明，针灸或针刺治疗可以促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白沉积，这表明注射过程本身可能部分掩盖rhCOL III注射的效果。最后，作者缺乏对rhCol III如何促进成纤维细胞增殖的彻底机制研究。总之，本研究的结果证明了皮内注射rhCol III在促进成纤维细胞增殖、增强Col I和Col III的沉积以及刺激血管生成方面的有效性。皮内注射不同浓度的rhCol III的主要区别在于它们对成纤维细胞增殖的影响。高浓度的rhCol III在促进成纤维细胞增殖方面更有效，这表现为在初始注射阶段后Col I和Col III的沉积增加。

参考文献

1. Xiang H, Sun Y, Chen Y, Wang G, Xie H. Injection of Different Concentrations of Recombinant Humanized Type III Collagen Into the Dermis Promotes Type III and Type I Collagen Deposition as Well as Angiogenesis: An In Vivo Study. Dermatol Surg. 2025 Jan 31. doi: 10.1097/DSS.0000000000004553. Epub ahead of print. PMID: 39887075.