随着分子遗传学和测序技术的快速发展，基因检测在精准癌症医学中的重要性日益凸显。癌症相关突变的早期检测可能为早期干预提供机会。常见的基因突变类型包括碱基替换和插入/缺失(indels)。随着癌症中突变标记物和靶向突变疗法的不断出现，对相关基因分型方法的需求日益突出。

目前临床检测indel的方法主要有FGS (Sanger测序)、下一代测序(NGS)、qPCR、ddPCR等。然而，这些方法在临床indel检测中有其局限性。例如，FGS和NGS都需要昂贵的测序仪和复杂的操作，FGS的检测限(LoD)为10% - 20%，不足以识别低丰度的突变。NGS的周转时间较长。qPCR和ddPCR检测需要昂贵的设备，并且不容易在一次检测中覆盖多个指标。值得注意的是，在癌症相关突变中，单个基因位点上的多个indel类型是常见的。因此，需要开发一种敏感、快速、低成本、方便、可应用于多种变异的癌症相关indel检测方法。

近日，杂志Nature communications上发表了一篇题为“CoHIT: a one-pot ultrasensitive ERA-CRISPR system for detecting multiple same-site indels”的文章。作者开发了一种one-pot ERA-Cas12a检测方法CoHIT，仅使用单个靶crRNA即可检测同一基因座上的多个插入/缺失。CoHIT的检出限为0.01%，30分钟内快速出结果，无野生型交叉反应。它成功地在108名AML患者中的30名中识别出NPM1突变，并显示出监测微小残留疾病(MRD)的潜力。CoHIT方法也适用于其他基因的检测，且与侧向层析测试和微流控芯片的集成突出了CoHIT的适应性和多路复用能力，有望在临床癌症诊断方面取得重大进展。

图片来源：Nature communications

主要内容

CoHIT系统工作流程

为了解决在一锅反应中检测同一位点多种indel变异的挑战，作者开发了CoHIT试验，使用了一种工程AsCas12a蛋白，表现出更高的错配耐受性和更广的PAM范围，仅用单个crRNA即可靶向多种变异(图a)。在CoHIT系统的工作流程中，直接将患者的基因组DNA加入到一锅ERA-Cas12a反应中，然后在39℃恒温下使用便携式荧光检测器在30分钟内实时读取荧光。该反应体系包括ERA试剂、一对引物、FAM-ssDNA-BHQ1报告子、工程AsCas12a蛋白enAsU-R和单个crRNA。Cas12a/crRNA复合体可以识别多个indel变体，但WT DNA不能诱导荧光信号，从而保证了CoHIT检测的特异性(图b)。

CoHIT系统的工作流程。

图片来源：Nature communications

CoHIT系统的建立与优化

为了检测多个同位点插入/缺失，作者通过功能氨基酸替换，设计了一个Cas12a变体，可以容忍更多的碱基错配。作者使用它建立了耐错配CoHIT系统，将Cas12a/crRNA检测与ERA等温扩增相结合，建立了一锅ERA-Cas12a检测方法CoHIT，可用单个crRNA检测多个相似DNA序列。经过多参数优化，当输入100 ng基因组DNA时，CoHIT系统成功实现了NPM1几种突变的LoD均为0.01%(图m-o)，且没有观察到WT诱导的交叉信号。

CoHIT系统的建立与优化。

图片来源：Nature communications

使用CoHIT系统检测其他癌症相关基因插入/缺失

为了进一步证明CoHIT系统的多功能性，作者检测了其他与癌症相关的基因插入/缺失。首先测试了KIT基因p.W557_K558del突变，与胃肠道间质瘤的肝转移密切相关。结果显示，两种缺失变体在大约10分钟后开始发出快速增加的荧光信号，并且在WT样本中没有观察到明显的交叉信号，表明CoHIT系统是敏感和特异性的(图a)。

除了KIT基因缺失外，还检测了BRAF和EGFR基因中的indel。与KIT检测类似，CoHIT系统对BRAF基因p.V487_T491del变异和EGFR基因p.E746_A750del变异均表现出良好的敏感性和特异性(图b、c)。这些成功的应用进一步证明了CoHIT系统在基因indel检测中的多功能性和有效性。

使用CoHIT系统检测其他与癌症相关的基因的插入。

图片来源：Nature communications

CoHIT系统在临床样品中的检测

为了评估CoHIT系统的临床适用性，作者使用来自108名AML患者的100 ng DNA进行CoHIT测定NPM1突变状态，并使用FGS和NGS进行比较。在39°C下反应30 min后，108个样品中有30个在CoHIT实验中显示出阳性荧光信号，这与NGS结果完全一致。但FGS遗漏了4个低突变率的阳性样本，表明CoHIT的灵敏度高于FGS(图b)。值得注意的是，CoHIT系统成功检测到4例其他插入类型的患者，包括P33 (39.9% insCATG)、P48 (21.0% insCTTG)、P65 (46.7% insCCTG)和P70 (31.0% insCATG)(图c)。

CoHIT系统在临床样品中的检测。

图片来源：Nature communications

CoHIT系统监测微小残留疾病(MRD)

作者测试了CoHIT系统检测NPM1突变AML患者残留白血病的能力，使用FGS、NGS和CoHIT方法对这些样品进行同时测试以进行比较分析(图d)。CoHIT结果检测到患者- MRD -1在初始诊断时NPM1突变阳性(图e, f)。经过几个疗程的化疗后完全缓解，但在后续样品中检测到insTCTG突变（NGS证实0.1%突变）。几个月后的复发样本中，荧光信号逐渐增加（NGS证实分别为1.6%和41.1%的insTCTG突变）。其余两个患者CoHIT结果也和NGS结果完全一致(图g)。

CoHIT系统监测微小残留疾病(MRD)。

图片来源：Nature communications

CoHIT系统可以与测流层析试纸结合具有多重检测的潜力

CoHIT还可以与测流层析试纸(LFA)相结合，以更方便地应用。为了建立CoHIT-LFA系统，将CoHIT系统中的报告子替换为生物素- ssDNA -FAM报告子。将CoHIT反应时间设置为90 min，检测2例NPM1-WT患者和8例NPM1突变患者。结果表明，CoHIT-LFA方法成功地区分了阳性和阴性患者样本(图e)。

CoHIT还可以与微流体设备集成，以实现多重基因检测。反应室预注射CoHIT系统，并将引物对和crRNA放置在反应室中。在39℃下反应30min后，蓝光下观察芯片上的荧光信号(图f)。0.1%突变率样品的荧光信号可以用肉眼观察到，灵敏度较好(图h)。最后，利用CoHIT芯片检测6例AML患者，成功鉴定出5个NPM1突变样本。总的来说，这些结果证明了CoHIT检测的灵活性和多路复用潜力。

CoHIT-LFA系统和基于微流控芯片的CoHIT检测。

图片来源：Nature communications

总结与讨论

作者介绍了CoHIT，一种基于CRISPR的one-pot检测indel的方法。CoHIT利用具有高错配耐受性和PAM范围广的工程AsCas12a蛋白变体，可以使用单个crRNA检测急性髓性白血病(AML)中多个NPM1基因c.863_864 4-bp插入。经过多项参数优化，CoHIT的检出限为0.01%，30分钟内快速出结果，无野生型交叉反应。在108名AML患者中的30名中识别出NPM1突变，并通过对3名患者的连续样本分析显示出监测微小残留疾病(MRD)的潜力。CoHIT方法也适用于KIT、BRAF和EGFR基因的检测。与侧向层析测试和微流控芯片的集成突出了CoHIT的适应性和多路复用能力。

然而，它在前期突变分析中的效用可能有限，因此更适合定期随访、疗效评估和MRD监测。综上所述，CoHIT方法不仅敏感、特异、快速、方便，而且具有成本效益，在癌症分类、疗效评估、耐药突变预警、MRD检测等护理点检测应用中具有很大的优势。相信这个系统在推进精准癌症医学方面具有巨大的潜力。